用户文章New Phytol：苹果m6A修饰调控干旱胁迫 | m6A专题

论文标题：MdMTA-mediated m6A modification enhances drought tolerance by promoting mRNA stability and translation efficiency of genes involved in lignin deposition and oxidative stress

刊登日期：2022年05月

发表杂志：New Phytol

影响因子：10.323

研究机构：西北农林科技大学

技术手段：m6A-seq、RNA-seq

图1 研究思路

（一）主要研究内容

1.m6A甲基化对干旱胁迫的响应

图1 正常和干旱条件下苹果中m6A分布

图2 干旱对苹果m6A RNA甲基化和转录组的影响

为探究m6A甲基化对苹果干旱胁迫的响应机制，作者构建了野生型苹果植株GL-3模型并在干旱和正常条件下进行试验，m6A-seq结果显示m6A的peak显著富集在3’UTR上，但与其他植物物种不同的是其peak也显著富集在CDS区。GO富集分析显示干旱胁迫后部分高甲基化或低甲基化基因富集在干旱相关通路、水分剥夺和氧化应激。通过m6A-seq和RNA-seq联合分析，结果发现干旱胁迫下发生m6A修饰基因上调的数量大于下调的数量，且高甲基化和低甲基化基因的表达水平都有增加。

2、MdMTA是m6A的甲基转移酶对干旱胁迫响应

图3 苹果MTA基因鉴定

干旱处理导致苹果m6A水平的变化，通过对甲基转移酶MdMTA进一步分析，系统发育分析显示MdMTA与MTA基因具有高度的相似性（图3a）；一项体外甲基化实验表明，只有METTL14（植物中称MTA）具有催化活性，而不是METTL14（植物中称MTB）。接着作者通过酵母双杂交（Y2H）证实MdMTA与MdMTB有相互作用，并且通过体外甲基化实验发现MdMTA和MdMTB同时存在的情况下SAM的甲基才能转移到合成的RNA探针的腺嘌呤上（图3c-d），表明MdMTA确实在苹果甲基转移中起作用，亚细胞定位显示MdMTA定位在细胞核（图3e）。另外，通过测试干旱处理下后MdMTA的表达水平显示随处理时间延长MdMTA表达上调（图3f-g），表明MdMTA对干旱胁迫有响应。

3、MdMTA对m6A的修饰和植物的发育至关重要

图4 MdMTA介导的m6A RNA甲基化和转录组变化

图5 MdMTA转基因植株在短期干旱条件下的抗旱性

作者在通过构建MdMTA干扰（RNAi）和过表达（OE）转基因株系，通过斑点杂交实验表明MdMTA-RNAi植株总RNA m6A水平较低，而MdMTA-OE植株总RNA 的m6A水平较高，表明苹果m6A修饰需要MdMTA。接着作者通过其中MdMTA蛋白水平较低的MdMTA-RNAi系进行m6A-seq，与GL-3测序结果联合分析显示与GL-3植物的m6A分布相比，MdMTA-RNAi植物在3’UTR的高甲基化peak显著减少，同时CDS区域增加（图4d），与m6A的功能一致，干扰MdMTA可降低大多数差异peak基因的m6A水平，表明MdMTA对m6A修饰至关重要。

为了研究MdMTA介导的m6A甲基化与表达水平之间的潜在相关性，对MdMTA-RNAi植物进行了RNA-seq，通过将差异基因与发生m6A修饰的基因进行比较，发现MdMTA-RNAi植物与GL-3植物中上调转录本的数量（1773）与下调转录本的数量（1628）相等（图4e-g），表明MdMTA介导的m6A修饰对基因表达的影响不是简单的均匀上调或下调。通过对3个月大的MdMTA转基因植株的形态特征进行分析，发现MdMTA-RNAi植物的株高低于GL-3植物，而MdMTA-OE植物的株高与GL-3植物相似，MdMTA-RNAi植物的根系比GL-3植物弱(图5a)。

为了避免发育缺陷对抗旱性的影响，作者选择转基因MdMTA幼苗和生长状态相同的GL-3植株进行短期干旱处理，与GL-3植株相比MdMTA-RNAi植株表现出更早的枯萎和更低的存活率，而MdMTA-OE植株表现出更少的枯萎和更高的存活率(图5b-d），MdMTA-OE植株具有更高的光合能力、气孔导度、胞间CO2浓度和蒸腾速率，表明MdMTA对干旱胁迫具有正向调控作用。

4、MdMTA介导的m6A甲基化调控干旱胁迫下的基因表达

图6 干旱胁迫下MdMTA介导的苹果m6A甲基化

图7 苹果中MdMTA介导的m6A修饰上调基因表达水平

对干旱处理后的MdMTA-RNAi植株和GL-3植株进行了m6A-seq和RNA-seq，结果表明在干旱条件下MdMTA-RNAi中含有m6A的转录本表达水平略低于GL-3植物（图6a）；在MdMTA-RNAi植株中，3’UTR中m6A修饰的转录本上调，而在其他区域修饰的转录本下调；与GL-3植物相比，干旱条件下MdMTA-RNAi植物中更多低甲基化基因的表达量呈下降趋势，而在正常条件下呈上升趋势(图6c-d)。在对低甲基化peak与基因表达水平进行分析，在干旱胁迫下MdMTA-RNAi植物中MdLEA的同源物（干旱胁迫的正调控因子）表达下调，在MdMTA-OE植物中表达上调（图7a），提示MdMTA可能通过影响干旱条件下木质素生物合成和H2O2清除相关基因的表达来应对干旱。

通过IP-qPCR检测图7-a中6个基因在MdMTA转基因植物中的m6A水平，结果表明在干旱胁迫下，MdMTA-RNAi植物的m6A水平显著降低，MdMTA-OE植物的m6A水平显著升高(图7c)。

5、MdMTA介导的甲基化可稳定mRNA，提高干旱胁迫下mRNA的翻译效率

图8 m6A水平下调会导致干旱条件下mRNA的稳定性和翻译效率降低

为研究MdMTA诱导的m6A修饰对mRNA稳定性的影响，作者检测在干旱条件下添加转录抑制因子放线菌素后的基因表达水平，结果表明在干旱胁迫下MdMTA-RNAi植物的MdLEA、MdLAC4、MdORM2、MdMYC4和MdMPV17 基因表达水平的稳定性低于GL-3植物（图8a）；在MdMTA是否调控Md4CL3的翻译效率的研究中，与GL-3植物相比干旱胁迫下MdMTA-RNAi植物Md4CL3 mRNA的翻译效率确实有所降低（图8b）；以上结果表明MdMTA通过调节这些基因的mRNA稳定性和翻译效率来响应干旱胁迫。

图9 短期干旱处理的GL-3和MdMTA转基因植株的木质素含量、过氧化氢和酶活性

接着作者检测了GL-3和MdMTA的植株的木质素含量，与GL-3植物相比干旱条件下MdMTA-RNAi植物的木质素含量较低，MdMTA-OE植物的木质素含量较高（图9a）。通过2个月的干旱实验，与短期干旱结果相比，正常条件下MdMTA RNAi植株的木质素含量也显著降低，在正常和干旱条件下MdMTA-RNAi植物的根系水力传导率始终低于GL-3植物。另外，与GL-3植物相比，干旱处理后MdMTA-RNAi植物的H2O2含量较高，MdMTA-OE植物的H2O2含量较低(图9b-c)；与GL-3相比干旱胁迫下MdMTA-RNAi植物中MDA含量较高，MdMTA-OE植物中MDA含量较低(图9d-e)，说明MdMTA-RNAi植物的抗氧化防御机制严重受损。同时，与GL-3相比，干旱条件下MdMTA-RNAi植物中氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性显著降低，MdMTA-OE植物中这些酶活性较高(图9f-i)。

图10 干旱条件下m6A水平下调导致与CAT和POD酶相关的mRNA稳定性和翻译效率降低

为明确MdMTA如何影响CAT和POD酶的活性，检测干旱处理后MdMTA-RNAi和GL-3植物的RNA-seq中酶编码基因进行验证，在干旱条件下MdMTA-RNAi植物中MdCAT1、MdCAT2、MdPOD63和MdPOD66的表达水平下调，而MdMTA-OE植物中表达水平上调(图10a)。在IP-qPCR结果显示与GL-3植物相比，干旱条件下MdMTA-RNAi植物中这些基因的m6A水平较低，MdMTA-OE植物中m6A水平较高(图10b)。同时这些基因的稳定性和翻译效率在干旱条件下低于GL-3，在正常条件下没有差异。综上，MdMTA通过介导CAT和POD酶编码基因的m6A修饰，从而调控这些酶mRNA的稳定性和翻译效率促进H2O2的清除。

（二）总结

该研究利用m6A-seq测序显示通过识别植物特异性序列基序UGUAH（M=A、U或C），m6A主要富集在CDS和3′UTR，其是苹果对干旱胁迫响应的区域。同时鉴定了m6A甲基转移酶复合物的一个催化活性组分MdMTA。体外甲基转移试验、斑点印迹杂交和m6A-seq结果表明，MdMTA作为甲基转移酶对m6A 修饰至关重要。干旱条件下m6A-seq和RNA-seq结果表明，MdMTA介导m6A修饰以及参与氧化胁迫和木质素沉积的mRNA转录。此外，m6A修饰促进mRNA稳定性以及干旱胁迫响应基因的翻译效率。另外，MdMTA增强干旱条件下木质素沉积和活性氧清除。综上，该研究揭示了m6A修饰参与多年生苹果树的干旱响应，并解析了其分子机制，为抗逆苹果品种的选育提供了候选基因。

相关阅读

点击下方图片进入云平台资料汇总：

所见即所得，绘图高规格联川云平台，让科研更自由